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BEH Amide色譜柱分離單糖、二糖、多糖的技巧

更新時間:2024-10-24      點擊次數:1535

1. 如果分離不含還原糖(如下文所示)的糖類或含糖化合物,請遵循前文的一般建議。

2. 如果分離還原糖,請查看以下信息。

3. 還原糖可以發生變旋,導致α環與β環形式的糖(差向異構體)產生,這是一種不良分離。

4. 升高溫度和pH值可使差向異構體合并成一個峰:

5. 35 ℃下使用高pH0.2%三乙胺(TEA)0.1%氨水(NH4OH))和/

6. 在高溫下(> 80 )使用0.05% TEA (>80 )

7. 分離還原糖(例如果糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、甘油醛等)時,請注意遵循以下建議。否則會導致這些分析物出現分裂峰(差向異構體分離):

a. 以低流速運行(例如,在2.1 x 50 mm色譜柱上流速設置為0.10~0.13 mL/min),促進差向異構體峰合并。

b. 色譜柱較長時,可采用較高的流速(例如0.3 mL/min)。和所有LC分離一樣,理想流速應通過實驗來確定。

c. 向兩個流動相(例如A2B2等)儲液瓶中加入三乙胺(TEA)或氨水(NH4OH)改性劑。

d. 對于單糖和/或二糖的UPLC/ELSD分離,典型的等度UPLC條件包括:

i. 含有0.2% TEA75%乙腈(ACN)35 °C0.13 mL/min2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱;

ii. 含有0.05% TEA77%丙酮,85 °C0.15 mL/min2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱;

iii. 含有0.2% TEA75% ACN35 °C0.2 mL/min2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱。

e. 對于更復雜的糖類混合物(例如多糖)的UPLC-ELSD分離,典型的梯度UPLC條件包括(流動相AB中都需要添加TEA):

i. 10 min內梯度從80%變化至50% ACN(含0.2% TEA),35 °C0.13 mL/min2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱,或使用2.1 x 150 mm BEH Amide色譜柱(流速升至0.3 mL/min);

ii. 10 min內丙酮從80%變化至55%(含0.05% TEA),85 °C0.15 mL/min2.1 x 100 mm BEH Amide色譜柱。

f. 對于單糖和二糖的UPLC-MS分離,典型的等度UPLC條件包括:

i. 75%ACN + 0.1% NH4OH35 ℃,0.13 mL/min2.1 x 50 mm BEH Amide色譜柱。

g. 對于更復雜的糖類混合物(例如多糖)的UPLC-MS分離,典型的梯度UPLC條件包括(流動相AB中都需要添加NH4OH):

i. 10 min內梯度從75%變化至45%ACN(含有0.1%NH4OH),35 °C0.2 mL/min2.1 x 100 mm

BEH Amide色譜柱。

6. 更復雜的樣品混合物可能需要使用梯度條件和/或更長的UPLC色譜柱。

7. 如果在一種或多種流動相中使用了丙酮,請勿使用丙酮作為樣品稀釋劑或針清洗溶劑。有關樣品稀釋劑建議和針清洗溶劑/灌注溶劑建議的其他技巧(3),請參閱進樣溶劑部分。

8. 含糖/多糖/碳水化合物時,典型樣品前處理建議如下:

a. 液體樣品

i. 使用50:50 ACN/H2O稀釋。

ii. 使用0.45μm0.22μm針式過濾器過濾(如有必要)。

b. 固體樣品

i. 稱取約3g樣品放入50 mL離心管中。

ii. 加入25 mL 50:50 ACN/H2O,混合均勻(機械混勻)。

iii. 3200 rpm下離心30 min

iv. 收集上清液,使用0.45μm0.22μm針式過濾器過濾(如有必要)。

c. 視樣品和/或分析物濃度而定,可能需要對樣品進行額外稀釋。

d. 更復雜并且/或者分析物濃度更低的樣品可能需要額外的樣品前處理步驟(例如固相萃取(SPE))。

e. 考慮使用VanGuard BEH Amide保護柱保護UPLC色譜柱。

f. 建議通過在工作流程中加入HILIC質量控制(QC)參比物質來監控系統的運行狀況。


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